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空(kong)肠(chang)弯(wan)曲菌(jun)的(de)活化与保藏

发布时间: 2021-03-26

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是一种(zhong)可以引起(qi)人类急(ji)性肠炎和食物中毒的(de)人畜共患病原(yuan)菌。该菌培养条(tiao)件苛刻,生长需(xu)要(yao)特(te)定的(de)环境,菌株(zhu)不易(yi)保存。通常(chang)在(zai)微需(xu)氧(yang)(yang)(5%氧(yang)(yang)气、85%氮气、10%二氧(yang)(yang)化碳(tan))、42±1℃环境下,可存活(huo)4~5d,最后因培养基表面干燥(zao)而导致菌体(ti)干燥(zao)死亡。


空肠弯曲菌的活化与保藏


一、空肠弯曲菌的活化方法


1.配制(zhi)弯曲菌活(huo)化肉汤


空肠弯曲菌的活化与保藏


a. 将各成分溶(rong)于蒸馏水(shui)中(zhong),经过(guo)0.22μm滤膜过(guo)滤除菌。FBP 根(gen)据需要(yao)量现用现配,在(zai)-70℃储存不超(chao)(chao)过(guo)3个月或(huo)-20℃储存不超(chao)(chao)过(guo)1个月。


b. 裂解(jie)脱纤维羊(yang)血提前从-70℃冰箱取出(chu)恢复至(zhi)室温。


c. 称(cheng)取(qu)CM125布(bu)氏肉汤并溶解灭菌,灭菌后冷却至(zhi)室温。每100ml基(ji)础加入5ml裂解脱纤维羊血(xue)和0.5ml FBP溶液,分装试(shi)管,即制备完成(cheng)。

空肠弯曲菌的活化与保藏


2.肉汤培养(yang)

从-70℃冰箱取出(chu)弯曲菌冻存甘油管,倾倒至弯曲菌活化肉汤中(zhong)。置于厌氧(yang)培(pei)养罐中(zhong),加入微(wei)需氧(yang)产气袋于42℃培(pei)养24h。


3.平板培养

取10ul肉汤培养物划线至哥伦比亚血平板(PB003A),42℃微需氧培养44±4h,观(guan)察(cha)菌落(luo)形态。典型菌落(luo)为灰色、扁(bian)平、湿润(run)有光泽,呈沿接种(zhong)线向外扩(kuo)散的倾向。

空肠弯曲菌的活化与保藏


4菌株验证

通(tong)过菌(jun)落形态和生化实验(yan)对菌(jun)株进行验(yan)证,确认后进行菌(jun)株保(bao)藏。

 

二、空(kong)肠弯曲菌(jun)的保藏(zang)方法(fa)


1.双倍布(bu)氏(shi)肉汤(tang)甘油保存(cun)管制(zhi)作:称取5.62g CM125布(bu)氏(shi)肉汤(tang)干粉,溶(rong)于70ml蒸馏水、30ml甘油中(zhong),灭菌后冷(leng)却至室温(wen),加入5ml裂解脱纤维(wei)羊血(xue)、0.5ml FBP溶(rong)液,混匀(yun)后分装(zhuang)到冻(dong)存(cun)管中(zhong),每管1ml。


空肠弯曲菌的活化与保藏


2. 使用接种环刮取哥(ge)伦(lun)比亚血平板上(shang)的纯菌(jun)落(尽可(ke)能多)至冻存管中,涡旋震荡(dang)5s,于-70℃长期保存。



三、注意事项


01

不建议使用磁珠管保(bao)藏弯曲菌,存活率(lv)不如甘油(you)冻存管。

02

-20℃保(bao)存(cun)的效果(guo)不如-70℃冰(bing)箱,如果(guo)使(shi)用-20℃保(bao)存(cun),应半年进行一(yi)次传代。

03

如果短期(qi)保存,可(ke)将厌氧罐同(tong)试管/平板放入2-8℃冰箱,一(yi)星期(qi)内使(shi)用(yong)。



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参考文献:

1.        陈晶晶.弯曲菌肠炎[J].中华流行病学杂志, 1986, 7 (4) :245-249

2.        栾军, 祝长青, 蒋原, et al..空肠弯曲菌保存方法的比较[J].口岸卫生控制, 2006, 12(4):15-17.

3.        栾军, 祝长青, 蒋原, et al. 空肠弯曲菌选择性增菌培养和分离方法的比较[J]. 中国人兽共患病学报, 2008, 24(002):117-119.

4.        GB4789.9-2014 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验[S].